En 1836, Urquiza acompañó a Echagüe a Buenos Aires y se encontró con Juan Manuel de Rosas quien lo puso al mando de la división federal de observación en la frontera uruguaya; durante los quince años siguientes, Urquiza, un federal convencido, sirvió a Rosas como oficial militar y aliado político; colaboró en la defensa de Paysandú (1837); en esos años se produjeron sangrientas guerras civiles en el Uruguay y en las provincias argentinas de Entre Ríos y Corrientes; Rosas apoyó a Manuel Oribe y a sus partidarios en el Uruguay y su opositor Fructuoso Rivera contó con el apoyo de los unitarios; Juan Lavalle, José María Paz y Rivera estaban al mando de los unitarios al tiempo que Oribe comandaba las tropas federales de Rosas y Urquiza se convertía en un importante líder federal; en 1841, Urquiza sucedió a Echagüe como gobernador de Entre Ríos pero se vio obligado a delegar el poder y a retirarse del otro lado del Paraná con sus tropas cuando el este de Entre Ríos fue invadido y ocupado por las fuerzas unitarias del Uruguay; el general José María Paz tomó Paraná; finalmente, hacia 1845, se había hecho la paz con Corrientes y después de que la derrota en Arroyo Grande había hecho replegar a Rivera al Uruguay en 1842. Urquiza invadió ese país y derrotó a aquél completamente en India Muerta, el 27 de marzo de I845; a su regreso a Entre Ríos, encontró a su provincia amenazada otra vez por fuerzas correntinas dirigidas por el unitario Madariaga y por el general Paz. La derrota por Urquiza de estas fuerzas, seguida por un tratado de paz, marcó el comienzo de las desavenencias entre él y Rosas.

Urquiza nombró gobernador de Corrientes a su amigo Benjamín Virasoro; habiendo sido reelecto gobernador de Entre Ríos en diciembre de 1845, hacia 1847 se había convertido en el líder político más importante de la Mesopotamia argentina.

La ruptura final entre Urquiza y Rosas se produjo en 1851 con su manifiesto del 1° de mayo, que afirmaba que Entre Ríos reasumía sus derechos soberanos y convocaba la reorganización nacional; propuso que las divisas "Viva la Confederación Argentina!" y "¡Mueran los salvajes unitarios!" fueran reemplazadas por "¡Mueran los enemigos de la organización nacional!"; sólo Corrientes lo apoyó en ese momento.

El 29 de mayo de 1851 se firmó una alianza entre Brasil, Entre Ríos y el gobierno de Montevideo contra Oribe (aliado de Rosas); Rosas respondió declarando la guerra al Brasil; después de obligar a Oribe a capitular, Urquiza replegó su ejército a Entre Ríos; el 24 de diciembre de 1851, cruzó el Paraná con el Ejército Grande Libertador y llegó a las cercanías de Buenos Aires; en la histórica batalla de Caseros el 3 de febrero de 1852, obligó a Rosas a rendirse y a renunciar.

Urquiza se dedicó, a partir de ese momento, a la tarea de lograr la organización nacional; el 31 de mayo de 1852, la mayoría de los gobernadores provinciales firmaron el Acuerdo de San Nicolás, por el cual Urquiza recibía el cargo de Director Provisional de la Confederación Argentina y convocaba un Congreso General Constituyente que se reuniría en Santa Fe en agosto, en septiembre, la provincia de Buenos Aires se retiró de la Confederación, por la sospecha de parte de los exiliados que regresaban de que Urquiza podía ser otro Rosas y además porque la mayoría de los porteños creían que la reorganización debía realizarse bajo la dirección de Buenos Aires, así como también por el permanente deseo de mantener los beneficios de los impuestos portuarios para su propia provincia; mientras continuaban las hostilidades.

Los representantes de las otras provincias argentinas se encontraron en el Congreso de Santa Fe y redactaron la Constitución Federal de 1853. La mayoría de las provincias la aceptó y en 1854 Urquiza comenzó su período presidencial de seis años como primer presidente constitucional de la República Argentina, con su capital en Paraná, Entre Ríos. Como presidente, firmó un tratado con España (1858) por el cual ésta reconocía la independencia argentina y establecía relaciones diplomáticas estimuló la inmigración y la creación de colonias agrícolas, una en Santa Fe (Esperanza) y una en San José, Entre Ríos; firmó el tratado de libre navegación con Brasil; reconoció la independencia del Paraguay y nacionalizó la Universidad de Córdoba.

Por sus esfuerzos, la instrucción pública, el comercio, la producción, la industria, las ciencias y las artes, los transportes y las comunicaciones recibieron un extraordinario estímulo y el progreso llegó a todas las provincias; el problema de incluir a Buenos Aires en la Confederación parecía estar acercándose a la solución de 1859.

Aunque ciertos líderes de Buenos Aires pidieron como condición que Urquiza renunciara; los sucesos políticos de la provincia de San Juan, con el asesinato del gobernador Benavídez como consecuencia, reabrieron el conflicto, en la batalla de Cepeda, el 23 de octubre de 1859, el presidente Urquiza derrotó completamente a las tropas de Buenos Aires comandadas por el general Bartolomé Mitre.

El 11 de noviembre de 1859 se firmó el Pacto de la Unión Nacional en San José de Flores por el cual Buenos Aires sería incorporada a la Confederación; en 1860 Urquiza delegó la presidencia al recién electo Santiago Derqui y otra vez fue gobernador de Entre Ríos (1860-1864); continuó con sus anteriores esfuerzos para completar la reintegración de Buenos Aires a la Confederación pero comenzaron nuevas hostilidades.

El 17 de septiembre de 1861, Mitre, en ese entonces gobernador de Buenos Aires, venció a Urquiza en Pavón; se acusó a Urquiza de haberse rendido sin necesidad; se firmó una paz en la que Urquiza aceptó retirarse a Entre Ríos y permanecer alejado de la política; la organización nacional, por la que Urquiza había trabajado tanto, se logró por fin con Bartolomé Mitre como primer presidente y con Buenos Aires como capital.

La Guerra con el Paraguay significó serios problemas para Urquiza, que había mantenido estrechos vínculos y negocios con sus líderes; trató de usar su influencia con Francisco Solano López para evitar la guerra pero fue inútil; cuando López atacó Corrientes, Urquiza se pronunció en contra del Paraguay; y apoyó la causa argentina a pesar de la poca popularidad de la guerra en Entre Ríos.

Los federales provinciales en Entre Ríos, dirigidos por Ricardo López Jordán (el menor), se estaban levantando otra vez contra Buenos Aires; Urquiza fue acusado de venderse a los porteños; Cuando se propuso a López Jordán como gobernador en 1868, Urquiza temió que su influencia se usara con fines contrarios a la organización nacional y aseguró la gobernación para sí mismo; también apoyó para presidente a Sarmiento.

En febrero de 1870, Sarmiento visitó a Urquiza en su palacio de la gobernación; el 11 de abril de 1870, las fuerzas de López Jordán asesinaron a Urquiza en su casa y mataron a sus hijos, Justo y Waldino, en Concordia; López Jordán pasó a ser gobernador de Entre Ríos hasta que lo derrocaron las fuerzas nacionales.

Urquiza fue sepultado en la parroquia de Concepción del Uruguay; esta iglesia se convirtió en monumento nacional; después de su muerte, se nacionalizó el Colegio del Uruguay y se lo llamó Colegio Nacional Capitán General Justo José de Urquiza; en 1942, el edificio original se transformó en monumento nacional. Justo J. de Urquiza es una de las figuras más discutidas de la historia Argentina. muchas historias contemporáneas y otras escritas con anterioridad aún se hallan matizadas por las pasiones del período de Rosas.

Pero siempre se han reconocido sus aportes en la reorganización nacional bajo la Constitución Federal. Más recientemente, se ha valorado su clara visión de las necesidades económicas y culturales del país y sus aportes en todos esos campos; los historiadores modernos de su época tienden a enfatizar también sus contribuciones a la educación, a la libertad de prensa y al desarrollo económico; como comerciante de toda la vida, empresario y estanciero influyente, los intereses económicos personales y los de su país desempeñaron un papel importante, como también sus convicciones federales, en su insistencia acerca de la organización nacional y de la inclusión de Buenos Aires en la Confederación.